Método aplicado para la observación microscópica de algas vivas asociadas a microbialitas

Vladimir Betancourt García¹, Eleonor Cortés-López², Rosaluz Tavera^3*

¹Posgrado en Ciencias del Mar y Limnología de la Universidad Nacional Autónoma de México
²Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México.
³Laboratorio de Algas Continentales. Ecología y Taxonomía. Departamento de Ecología y Recursos Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México.

e-mail:r_tavera@ciencias.unam.mx

Introduction

Las microbialitas son depósitos sedimentarios resultado de la mineralización producida, inducida o influenciada por una comunidad bentónica microbiana embebida en sus sustancias exopoliméricas (EPS por sus siglas en inglés) (Dupraz et al. 2011). Existe un consenso en que las microalgas tienen un papel decisivo en la construcción y el desarrollo de estas estructuras por su actividad metabólica (Choo et al. 2002; Dupraz et al. 2011; Golubic 1976; Kupriyanova et al. 2007; Kupriyanova et al. 2013; Ludwig et al. 2005; Riding, 2000; Shiraishi et al. 2008; Winsborough & Golubić 1987; Winsborough 2000; Zavarzin 2002). El estudio de las microbialitas con su comunidad asociada promueve el planteamiento de hipótesis sobre la evolución del planeta desde el punto de vista geomicrobiológico (Buick 2001; Hofmann 2000; Shen & Buick 2004) y también profundiza el conocimiento sobre la biomineralización de ciertos organismos (Benzerara et al. 2014; Knoll 2003), por lo que existe un interés creciente en estudiar la relación entre las comunidades de microorganismos y la fase lítica de las microbialitas (Couradeau et al. 2013; Freytet & Verrecchia 1998; Gérard et al. 2013; Winsborough & Golubić 1987).

Como muestran estos estudios, la observación en vivo de microalgas en microbialitas, representa un reto metodológico cuando se requiere observar su relación espacial con la fase mineral, debido a que las microbialitas son estructuras opacas. La microscopía de epifluorescencia y principalmente la confocal han resultado ser herramientas muy útiles (Bosak et al. 2012; Brown et al. 1998; Couradeau et al. 2013; Douglas & Douglas 2001; Kus 2015; Solé et al. 2008; Seder-Colomina et al. 2012) ya que las algas son evidentes por la autofluorescencia de sus pigmentos fotosintéticos (Rost 1995) y que la microscopía confocal permite la investigación de la relación espacial de los elementos fluorescentes en al menos tres dimensiones de las muestras (Jerome et al. 2011). El procesamiento de las muestras para ambas microscopías y fundamentalmente para la microscopía confocal requiere de una atención particular para preservar la estructura en tres dimensiones (3D) de la muestra durante la observación (Jerome et al. 2011). Couradeau et al. (2015) sugieren que las observaciones sean a partir de muestras de microbialitas fijadas, incluidas y seccionadas, lo que permite el mantenimiento de la estructura en 3D y la observación del material en distintas microscopías. No obstante, las muestras altamente porosas o con comunidades poco cohesivas tienden a perder los talos de algas que no se encuentran fuertemente adheridos a la fase lítica de las microbialitas durante los procesos de fijación y de inclusión, por lo que en estos casos particularmente (pero no exclusivamente) es recomendable minimizar el procesamiento del material y analizar las muestras vivas.

Existen en el mercado dispositivos que facilitan el montaje y la observación de las células vivas como son las celdas de montaje y separadores de silicón; sin embargo, estos sistemas son poco adecuados para el montaje de fragmentos de microbialitas y sus algas asociadas debido a su poca capacidad volumétrica. Aquí presentamos una alternativa metodológica que permite resolver esta problemática sin contravenir a la obtención de imágenes de buena calidad de algas vivas de microbialitas en microscopía fotónica, de epifluorescencia y confocal.

Elaboración del dispositivo de soporte de muestra

El dispositivo para la observación de microalgas vivas de microbialitas que aquí proponemos se elaboró en una placa de acrílico (polímero de metil metacrilato, PMMA) cuadrada, de 80 mm de lado y 6 mm de espesor, con dos perforaciones circulares de 20 mm de diámetro, cada una sellada en una de sus caras con un cubreobjetos de 22 x 22 mm del No. 1 (Fig. 1). Como alternativa, es posible sellar las dos perforaciones con un solo cubreobjetos rectangular de 24 x 50 mm también del No. 1 (Fig. 1d). Las dimensiones de la placa se establecieron considerando la mayoría de los soportes para muestras de los equipos de microscopía; las dimensiones de las perforaciones se establecieron considerando las dimensiones de los cubreobjetos de fácil adquisición y en vista de la importancia del sellado final de la muestra. El material de la placa se seleccionó por su resistencia y capacidad de mecanización y moldeo.

El corte inicial de la placa de acrílico se realizó con una pulidora (amoladora) angular Bosch 4. ½” GWS 7-115, hasta obtener la forma cuadrada de las dimensiones señaladas anteriormente. Las perforaciones se obtuvieron con un tubo metálico de 20 mm de diámetro calentado previamente al rojo vivo. Los bordes exteriores e interiores de la estructura resultante se pulieron utilizando una lija de agua de grano 400, de tal manera que los acabados de la placa y de las perforaciones quedaron lisos. La placa perforada se preparó para montar el dispositivo en condiciones de esterilidad. Los cubreobjetos fueron adheridos por una cara de la placa con soldadura plástica Ceys™ para plásticos duros.

Montaje de la muestra

Una vez elaborado el dispositivo, se utilizaron pinzas de disección para colocar los fragmentos frescos de la microbialita en interior de los pozos formados por las perforaciones y el cubreobjetos, cuidando que la parte que se deseaba observar quedara en contacto con el cubreobjetos. El fragmento se seleccionó al microscopio estereoscópico de modo que contuviera la sección de interés y buscando un tamaño menor a la capacidad de la perforación del dispositivo (Figura 1b). Posteriormente, se cubrió el fragmento con una solución estéril y aún líquida, de agua-agar al 1%, a una temperatura entre 40 y 50 °C de tal manera que se evitó la formación de burbujas o huecos de aire en torno al fragmento, con el volumen suficiente para que el pozo quedara lleno hasta el borde.

Antes de la solidificación del agua-agar, se selló cada pozo con un cubreobjetos cuadrado de 22 x 22 mm, de grosor No. 1, evitando también la formación de burbujas. Para impedir la contaminación y la contracción del agua-agar por desecación, se recubrió el contorno del cubreobjetos con barniz de uñas transparente. Terminando todo el sellado, el dispositivo se manipuló en condiciones normales y se mantuvo a 4 °C hasta unos minutos antes de su observación, con el fin de disminuir la actividad metabólica de las células y evitar una posible generación de burbujas en la superficie del fragmento.

Observación al microscopio

La documentación de las poblaciones y células vivas de las microbialitas puede ser realizada a través de diferentes microscopías: estereoscópica, fotónica, de epifluorescencia y confocal (Figs. 2 y 3), teniendo en cuenta, para estas últimas, los intervalos de excitación y emisión de la fluorescencia de los pigmentos fotosintéticos de las microalgas de interés. Couradeau et al. (2015) presentan los picos de absorción y fluorescencia para los principales pigmentos fotosintéticos de cianoprocariontes en estado puro, a pH 7 (Cuadro 1) y pueden ser utilizados como referencia si se tiene en cuenta que la fluorescencia puede variar en vivo y que usualmente los picos de absorción y fluorescencia tienen un intervalo de más de 100 nm. En el cuadro 1 indicamos estos picos y los intervalos utilizados en otros trabajos con organismos vivos.

Discusión del método propuesto

El uso de diferentes técnicas microscópicas representa valiosas herramientas para el estudio de las comunidades microalgales que frecuentemente se encuentran en forma de agregados celulares o formando tapetes sobre las microbialitas (Couradeau et al. 2015). En este sentido, el uso del soporte de muestras que presentamos, nos proporcionó una opción eficiente para la obtención de imágenes en estos equipos, porque permite una examinación no destructiva; además los elementos utilizados, tanto los materiales del dispositivo como el medio de montaje, no obstruyen la identificación de la autofluorescencia de los organismos (Neu et al. 2004) y de minerales (MacRae & Wilson 2008), lo que posibilita distinguirlos para estudiar la relación entre las poblaciones de microalgas y la fase lítica de las microbialitas (Fig. 2).

La elaboración del dispositivo implicó tomar en cuenta la sencillez en su elaboración, la estabilidad de la muestra, la facilidad de trasportarla, su versatilidad en el uso de distintos equipos de microscopía y el cuidado necesario para realizar observaciones adecuadas. El dispositivo que proponemos aquí está fabricado con acrílico, un material fácil de conseguir y con alta resistencia, ligereza y maniobrabilidad. Al montar los fragmentos de microbialitas en el dispositivo vacío, es posible acomodar la muestra de tal forma que el área de interés se encuentre más cercana al cubreobjetos inferior (a través del cual se realiza la observación), lo que corresponde con las recomendaciones de Waters (2007) para la observación de material vivo en microscopía confocal. El que nuestra propuesta incluya dos pozos de montaje, permite tener de manera simultánea dos muestras listas para ser observadas sobre las platinas de los microscopios; lo que facilita la exploración de muestras al aumentar el tiempo efectivo de observación en los microscopios. No obstante, el dispositivo puede ser ajustado a uno o más pozos. La manufactura del dispositivo por lo tanto obedece a la necesidad de cada investigador. Las medidas que proponemos aquí resultaron efectivas para el montaje de fragmentos idóneos de microbialitas y la utilización del dispositivo en los diferentes microscopios fotónicos, con o sin epifluorescencia y sin que las distancias entre las platinas y los objetivos fueran un impedimento para lograr un buen enfoque (Nikon 80i tiene un intervalo de movimiento de la platina de 27 mm; Nikon OptiPhot-2, tiene un intervalo de 29 mm).

Debido a que la preparación y montaje de las muestras en microscopía confocal tiene un grado de dificultad mayor que en microscopía fotónica y de epifluorescencia (Pawley 2000), buscamos cumplir con los cuidados requeridos para el uso de esta microscopía en el método propuesto. Las precauciones que deben ser consideradas en la preparación y observación del material vivo en microscopía confocal han sido detalladamente expuestas por Waters (2007), quien precisa que lo elemental para una localización y cuantificación adecuada de la fluorescencia es la obtención de imágenes de la mayor calidad posible. Así, un aspecto importante es el establecimiento de las condiciones adecuadas para el mantenimiento de las células y su fluorescencia durante su observación, a la par de un montaje adecuado en relación con el tipo de microscopio utilizado. Usualmente, la estabilidad en la temperatura, la hidratación y el flujo de nutrientes es requerido para el mantenimiento de las células durante su observación en vivo (Waters 2007). En este caso, el método que proponemos permite el mantenimiento de los organismos a temperatura ambiente sin alterar su relación entre ellos y la fase lítica de las microbialitas y en una condición suficiente de humedad al estar incluidas en agua-agar, lo que resuelve estos problemas.
Algunos autores (Diaspro et al. 2006) hacen hincapié en que la observación y obtención de imágenes de calidad, tiene que tomar en cuenta el decaimiento de la florescencia de los fluorocromos que usualmente ocurre tras su exposición a las longitudes de onda que los excitan, pues después de cierto tiempo, su capacidad fluorescente puede perderse completamente y corresponde a su blanqueamiento. El observar los pigmentos fotosintéticos de microalgas vivas permite tiempos de observación suficientes para la exploración y la captura de imágenes simples y secuenciales, ya que se ha calculado que para cianoprocariontes planctónicas el blanqueamiento de los pigmentos fotosintéticos ocurre alrededor de 45 minutos para longitudes de onda azules, de 120 minutos para longitudes de onda verdes y superiores a 24 horas para las longitudes de onda rojas (Sinha et al. 2002). Por lo tanto, el montaje que proponemos aquí permite el mantenimiento de la autofluorescencia de los pigmentos para la obtención de imágenes de calidad, sin contaminación de la muestra. En este sentido, la manipulación en condiciones de esterilidad es para evitar que algún material alóctono pudiera alterar las observaciones.
Existen, además de la preparación y el montaje de las muestras, ciertas restricciones a considerar para la obtención de imágenes de calidad en microscopía confocal, como la captación de aberraciones esféricas (Inoué 2006; Waters 2007) que provocan una elongación axial y una asimetría de las imágenes. Para evitar o disminuir estas aberraciones, es necesario mantener una constancia entre el índice de refracción del medio en el que se encuentra el espécimen y el medio de inmersión del objetivo utilizado, a la par de un cubreobjetos de grosor adecuado a las características de los objetivos utilizados (Waters 2007). Para resolver estas restricciones, sugerimos la inclusión de las microbialitas en agua-agar al 1%, el uso de un lente seco o preferiblemente de inmersión en agua, y un cubreobjetos de grosor No. 1 (0.13 a 0.16 mm de espesor) o No. 1.5 (0.16 a 0.19 mm de espesor), que coincida con las especificaciones del lente empleado (en este caso utilizamos UPLFLN 10x con apertura numérica de 0.30).
Finalmente, si bien es cierto que este dispositivo se fabricó con la intención de contener muestras de microbialitas, no se descarta su uso para otras estructuras o sustratos opacos como rocas provenientes de cavernas o muestras de suelo en donde las células algales pueden ser evidentes por autoflorescencia. Igualmente, el uso de material fijado y de fluorocromos para el marcaje y observación de estructuras particulares puede ser explorado en función del tipo de investigación a realizar. Además, el dispositivo puede ser empleado en otras disciplinas (médicas y odontológicas) e incluso podría ser utilizado en la sujeción de muestras para la obtención de imágenes tomográficas ya que permite la estabilidad de la muestra en un medio de baja densidad.

Conclusiones

El diseño de este dispositivo de montaje permite: 1) el estudio de un volumen suficiente de muestras de microalgas vivas de microbialitas sin pérdida de células o alteración del arreglo 3D de la comunidad; 2) la pronta exploración de las muestras; 3) la estabilidad necesaria de las muestras durante su traslado para el uso de distintos equipos de microscopía y 4) la obtención de imágenes de buena calidad en distintas microscopías, cuando es acompañado de un montaje adecuado para las especificaciones técnicas de los microscopios. Debido a la versatilidad del dispositivo de montaje, es posible ampliar su uso al estudio de otras estructuras opacas y no sólo células con pigmentos autofluorescentes, al usar fluorocromos particulares.

Agradecimientos

Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada (LNMA) de la UNAM y particularmente al M. en C. Andrés Saraleguí Amaro y al Dr. Jaime Arturo Pimentel Cabrera por el apoyo en la observación, toma y análisis de las fotografías en microscopía confocal. Agradecemos también a: M. en C. Beatriz Lira Hernández por el apoyo en las observaciones en epifluorescencia; M. en C. Guadalupe Vidal por el apoyo en el establecimiento del montaje de las muestras; al Posgrado en Ciencias del Mar y Limnología y al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM y al CONACYT por los apoyos a VBG y ECL para la realización de estudios de posgrado.

REFERENCES.

Recibido: 3 noviembre 2016
Revisado: 16 enero – 15 mayo 2017
Corregido: 26 mayo 2017
Aceptado: 27 mayo 2017
Revisores: Gilles Pierre René Levresse y Andrés Saralegui Amaro