Melina Celeste Crettaz-Minaglia
Estudio del crecimiento de Microcystis aeruginosa y de la producción de microcistina en cultivo de laboratorio
Tesis de doctorado.
Laboratorio de Toxicología General, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. Calle 48 y 115, La Plata, Buenos Aires, Argentina. C.P. 1900.
Correspondencia: mcrettaz@exactas.unlp.edu.ar
Las floraciones de cianobacterias pueden encontrarse en lagos, lagunas, ríos y arroyos de todo el mundo y es posible observar que su ocurrencia es cada vez más frecuente durante todo el año. En Argentina, se han registrado en casi todas las provincias, siendo Microcystis aeruginosa una de las cianobacterias más frecuentemente reportadas junto con el género Dolichospermum. En este sentido, existe gran preocupación por el fenómeno de las floraciones de cianobacterias dado los múltiples efectos ambientales y sanitarios que ocasionan, siendo la producción de cianotoxinas uno de los aspectos más preocupantes.
En este marco, el objetivo de la presente Tesis Doctoral fue estudiar la influencia de los factores temperatura, irradiación y relación N:P sobre el crecimiento y producción de clorofila-a (clo-a) y MC-LR de M. aeruginosa cepa CAAT 2005-3, autóctona y de ambiente templado, en condiciones de laboratorio utilizando modelos matemáticos. Se realizó un diseño factorial combinando 3 niveles de temperatura (26, 30, 36°C), irradiación (30, 50, 70 μmol fotones m-2.s-1) y relación N:P (10, 100, 150). Los ensayos se realizaron en una cámara de cultivo por duplicado con un inoculo de 9.105-1.106 cél.mL-1 (D.O.740nm ≈ 0,1). En cada ensayo, se determinó periódicamente el número de células, el contenido de clo-a y de D-Leu1 [MC-LR], principal MC producida por la célula. Los datos obtenidos de recuento fueron modelados utilizando la ecuación de Gompertz y se calcularon los parámetros velocidad de crecimiento (μ), duración de la fase de latencia (LPD) y máxima densidad de población (MPD). También, se utilizó un modelo secundario tipo Arrhenius para evaluar los efectos de la temperatura en μ y LPD y el modelo modificado de Ratwosky para determinar las temperaturas óptima, máxima y mínima de crecimiento. La producción de clo-a se modeló utilizando un modelo lineal que permitió calcular el tiempo de duplicación medio (tm). La producción de D-Leu1 [MC-LR] se modeló utilizando un modelo dinámico que incluye el modelo de Gompertz y el modelo lineal de Long para evaluar la relación entre la producción de cianotoxina respecto a la velocidad de crecimiento. Además, para evaluar el efecto de todos los factores sobre los parámetros se utilizó un modelo de superficie de respuesta.
Los modelos propuestos y utilizados para modelar los datos se ajustaron a los datos experimentales con buenos coeficientes de determinación. Se observó que la temperatura y la irradiación incrementan los valores de μ (0,20-0,38 d-1 a 26° y 0,22-0,36 d-1 a 30°C), sin embargo, a máxima temperatura, la intensidad de irradiación no tiene efectos significativos (p<0,05) sobre los valores de μ (0,17-0,31 d-1 a 36°C). De modo similar, la temperatura y la irradiación también afectaron los valores de MPD observándose los valores máximos (7,19-7,44 cél.mL-1 a 26°C; 6,58-6,72 cél.mL-1 a 30°C y 6,33-6,50 cél.mL-1 a 36°C) a irradiación 50 μmol fotones m-2.s-1. Los valores de LPD se encontraron afectados por la temperatura y la relación N:P observándose menores valores en condiciones de exceso de nitrógeno y aumento de la temperatura. El modelo modificado de Ratkowsky permitió calcular las temperaturas cardinales: Tmin = 8,58 °C ±2,34, Tmax= 45,04 °C ± 1,35 y T óptima = 33,39 °C ±0,55. Los valores de energías de activación de μ fueron mayores en el dominio de temperaturas más bajas (83,08±0,9 kJ.mol-1 ) y menores en el dominio de temperaturas más altas (13,30±0,81 kJ.mol-1 ). Por el contrario, los valores de energías de activación de LPD fueron menores a temperaturas más bajas (50,32±0,19 kJ.mol-1 ) y mayores a temperaturas más altas (149,91±1,9 kJ.mol-1 ). Respecto a la producción de clo-a, los valores de tm fueron menores a baja irradiación y temperatura (2,90-3,41d a 26°C y 2,90-3,87d a 30°C, a 30 μmol fotones m-2.s-1). A 36°C, los tm fueron menores a alta irradiación (2,73-4,75d a 70 μmol fotones m-2.s-1) aunque se obtuvieron las menores producciones de clo-a (en μg.L-1). Por otra parte, la producción de D-Leu1 [MC-LR] se incrementó al disminuir la temperatura, a una relación N:P 10 y a baja intensidad de irradiación (30 μmol fotones m-2.s-1 ). El modelo de Long mostró que la producción de D-Leu1 [MC-LR] por célula se incrementa al incrementarse la velocidad de crecimiento. A partir de los parámetros obtenidos de los modelos utilizados, se aplicó un modelo secundario de superficie respuesta o polinomial que permite predecir, en el rango de estudio, el comportamiento de los parámetros de crecimiento y producción de D-Leu1 [MC-LR] de la cepa nativa de M. aeruginosa. Se observó que a 30 y 50 μmol fotones m-2.s-1 los valores de μ máximos ocurren a una temperatura cercana a los 30°C independientemente de la relación N:P y, de modo contrario, los valores de máximos de p ocurren a <30°C reduciéndose hacia 36°C. A 70 μmol fotones m-2.s-1, si bien es similar la relación de μ y p son similares, se observa que en este último parámetro hay un efecto de la relación de nutrientes reduciéndose hacia la N:P 100. En todas las irradiaciones, la LPD aumenta de la relación N:P 150 hacia N:P 10 y de 36 a 26°C y la MPD disminuye hacia las temperaturas más elevadas y de modo independiente a la relación N:P.
Por otra parte, la irradiación se correlacionó positivamente con la velocidad de crecimiento (r=0,70) y el tiempo de generación (r=0,62); la temperatura se correlacionó inversamente con la MPD (r= -0,90); la relación N:P se correlacionó inversamente con la LPD (r= -0,60) y RLPD (r= -0,54). En el caso de los parámetros de producción de MC, p y dM, y de clo-a, k0, no se observaron correlaciones con ninguno de los factores estudiados. Esto se debe, al igual que alguno de los coeficientes bajos, a que, en la mayoría de los parámetros, se hallaron efectos combinados.
Este es el primer trabajo en dónde, además de modelar la curva completa de crecimiento de M. aeruginosa de una cepa nativa argentina de ambientes templados, se modeló la producción de sus metabolitos (clo-a y D-Leu1 [MC-LR]) evaluando los efectos de los principales factores que determinan la formación de floraciones cianobacterianas de esta especie en el ambiente natural. Si bien el desarrollo experimental de la presente Tesis Doctoral fue en condiciones de laboratorio, este es el primer acercamiento global al comportamiento de una cepa nativa frente al conjunto de factores ambientales (temperatura, irradiación y relación N:P). Esto permitió determinar que la producción de toxina es un proceso acoplado a la velocidad de crecimiento y que la velocidad de crecimiento de la cepa es más susceptible a los cambios térmicos a bajas temperaturas y, de modo contrario, que la recíproca de la duración de la fase de latencia es más susceptible a los cambios térmicos a altas temperaturas. Asimismo, debido a la generación de gran cantidad de datos dentro del diseño experimental propuesto, se pudieron utilizar diversas herramientas matemáticas como los modelos primarios y secundarios que, finalmente, permitirían el desarrollo de un Software como herramienta de alerta temprana que puede ser utilizada en la toma de decisiones frente a la problemática ambiental de las floraciones cianobacterianas.
Palabras clave: Cianobacterias. Cianotoxina. Modelado matemático.
Texto completo disponible en: Biblioteca de la Universidad Nacional de La Plata, SEDICI. http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/65910